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本试剂盒一种相对于仅基于线粒体膜电位分析更直接的检测线粒体通透性转换孔开放的检测方法。其原理是：首先通过被动运输加载Calcein AM，后者是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透活细胞膜，被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内，使胞质包括线粒体发出强绿色荧光。加入CoCl2后，来自胞质的荧光被CoCl2淬灭，仅留下线粒体内的荧光。作为对照，可将细胞加载Calcein AM和CoCl2的同时，对其用离子霉素处理，从而使细胞加载更多的Ca²⁺，引起线粒体通透性转换孔的激活从而使线粒体荧光淬灭。以1mL标记体系计算，本试剂盒可供100次检测。检测最大激发波长494nm，最大发射波长517nm。

线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)，又称线粒体巨型通道(magachannel)，是存在于线粒体内外膜之间的非选择性高导电性通道，由多种蛋白质复合组成。线粒体通透性转换孔(mPTP)可能参与了细胞死亡过程中线粒体成分的释放。

正常的细胞线粒体内膜可维持正常的线粒体电位梯度以保证细胞呼吸作用及能量供应，随着Ca²⁺的摄入和释放，一种低电导渗透性转换孔在张开和闭合中来回切换。当细胞发生凋亡时和病理性死亡时，线粒体膜电位转换孔渗透性发生改变，Ca²⁺的过载，线粒体谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后继细胞色素C的释放，线粒体膜电位下降等都会导致线粒体渗透性转换孔的激活。

• 1mM Calcein AM储存液制备
  取出试剂并回温至室温，吸取50 μLDMSO溶解1管Calcein AM，混匀后避光保存。
  注：钙黄绿素一旦溶解后，建议设置一系列实验将其短时间内用完，不能长期保存钙黄绿素溶液。
  
• 细胞染色(流式分析)
  
  • 用本试剂盒含有的Cell Stain Buffer将细胞制备成单细胞悬液，使其密度为1×10⁶细胞/mL。
    注：
    ① 用于离子霉素对照样品的缓冲液必须含有Ca²⁺；
    ② 钙黄绿素加载时不能含有血清；
    ③ 细胞必须为单细胞悬液。
    
  • 按照1mL每管将细胞悬液等分，每个样品等分成3份。
    后续染色顺序：1号管仅含钙黄绿素，2号管含钙黄绿素和CoCl2，3号管含钙黄绿素，CoCl2和离子霉素，另外准备一管不含试剂的细胞样品用于相应的仪器设置。
    
  • 用Cell Stain Buffer 1:500稀释1mM Calcein AM储存液，制备成2μM的工作液，例如取5μL 1mM储存液加入2.5mL Cell Stain Buffer，混匀即可。
    
  • 向上述每个样品的3管中分别加入5μL Calcein AM工作液并混匀。
    
  • 向2号、3号管中加入5μL CoCl2，并混匀。
    
  • 向3号管中加入5μL Ionomycin(100μM)，并混匀。
    
  • 在37℃避光孵育15min。
    
  • 向每管中加入3.5 mLCell Stain Buffer，离心收集细胞。
    注：此步可去除多余染料以及可能引起荧光淬灭的试剂。
    
  • 用400μL同时可用于流式检测的合适的缓冲液重悬细胞团。
    如果需要，也可进行进一步染色。如用标记的Annexin V检测磷酯酰丝氨酸易位；用PI检测细胞活力；或者用MitoTracker红色探针检测线粒体活力等。注意整个过程均需避光操作。
    
  • 染色后，将样品置于冰上，1h内进行流式分析。
    
  • 用不含试剂的细胞样品进行相应的仪器设置。用流式488激发器进行荧光分析，Calcein AM最大激发波长494nm，最大发射波长517nm。
    1号管-仅含钙黄绿素：线粒体和胞浆有荧光，荧光信号较强；
    2号管-含钙黄绿素和CoCl2：仅线粒体呈现荧光，荧光强度居中；
    3号管-含钙黄绿素，CoCl2和离子霉素：线粒体和胞浆荧光均被淬灭，荧光信号最弱。
    2号管和3号管荧光信号的变化说明线粒体通透性转换孔被不断的激活。